تطور أجهزة البلمره

تفرعات عن جهاز PCR بعد ظهور تقنية PCR تفرعت عنها تقنيتين اثنيتن 1- (RT-PCR) Reverse transcriptase Polymerase chain reaction) أحيانا" يكون مطلوبا" تضخيم عينة من RNA وليس DNA وربما أبرز مثال على ذلك هو فيروس الايدز الذي لا يحتوي على DNA بينما يستعمل RNA كمادة وراثية له ولذلك لا نستطيع تطبيق تقنية PCR مباشرة لدراسة فيروس الايدز تعتمد هذه التقنية على عمل أنزيم آخر اسمه Reverse transcriptase وهو يقوم بنسخ RNA إلى DNA والذي يسمى cDNA (Compelementary DNA) أي أن هذا الأنزيم يعمل بالطريق المعاكس (لأن الطريق الطبيعي هو تحول DNA إلى mRNA) لذلك سمي reverse بعدها يمكن ادخال cDNA إلى تفاعل الPCR لتضخيمه كما شرح سابقا" اذا" هذه التقنية تكون على مرحلتين 1- المرحلة الأولى وهي تحويل RNA إلى cDNA 2- المرحلة الثانية هي تضخيم cDNA عن طريق تفاعل PCR قبل شرح التقنية الثانية المتفرعة عن PCR يجب المرور على طريقة الكشف عن المنتج النهائي ل PCR أو ما يسمى PCR product فبعد اكتمال الثلاثين دورة مثلا". كيف سنعرف النتيجة؟ الجواب مع تقنية مخبرية اسمها الرحلان الكهربائي على جيل من الأغاروز Agarose gel electrophoresis تعتمد هذه التقنية أن جزئ DNA هو سالب الشحنة وبالتالي سيتجه نحو القطب الموجب في حال وضع ضمن حقل كهربائي وتختلف السرعة حسب حجم DNA فالأقل حجما" يتحرك بشكل أسرع عند تحضير الجيل يوضع فيه مركب ايديتيوم برومايدEthidium bromide وهو عبارة عن مادة كيميائية لها القدرة على الارتباط بجزئ DNA ويعطي اشعاعا" عند تعريضه للأشعة فوق البنفسجية وهكذا تترك العينات لتهاجر على الجيل ثم يتم تعريضها للأشعة فوق البنفسجية على أنه يلزم وجود عياري نستطيع مقارنة العينة معه إذ أن وجود العينة بمفردها لن يعطي أي فكرة عنها لذلك يتم ترحيل جزئ معروف الوزن من DNA بالاضافة للعينات التي نريد دراستها ويتم المقارنة بينهما وبالعودة للشكل المرافق نلاحظ على طرف الجيل رقم 3 وجود عمود مؤلف من خطوط منفصلة هذه الخطوط تكون عبارة عن أحجام مختلفة ومعروفة ومحددة سلفا" من DNA ويتم مقارنة العينات المجهولة معها

2- Real-time polymerase chain reaction: إن طريقة الكشف عن DNA بالايثيديوم برومايد المذكورة في المشاركة السابقة هي طريقة غير كمية بمعنى أنها لا تعطي فكرة عن الكمية الحقيقية لDNA ضمن العينة وإنما هي مفيدة لمعرفة وجود DNA من عدمه ولمعرفة الحجم التقريبي له بالمقارنة مع العياري Standard ولذلك جاءت تقنية Real time PCR هذه التقنية هي تضخيم وكشف وتحديد كمية DNA في وقت واحد فهذه التقنية تقوم بنفس مبدأ PCR تماما" من حيث إجراء تفاعل التضخيم بواسطة DNA polymerase ومن حيث ضرورة وجود Primers وكذلك شوارد المغنيزيوم والوقاء الحافظ لدرجة الحموضة وغيرها ومن حيث إجراء عدد كبير من الدورات واختلافات درجة الحرارة أي بالمختصر هي نفسها PCR ولكن بزيادة مركب اسمه SYBR green هذا المركب يرتبط بجزئ الDNA ثنائي السلسلة وليس بسلسلة منفردة وهذه ميزة للتفريق بين DNA و RNA وبين DNA و cDNA وهو مثل الايثيديوم برومايد يعطي اشعاعا" عند ارتباطه مع DNA ولكن الفرق أنه يعطي اشعاع أقوى بمراحل من الايثيديوم برومايد وأن الاشعاع يقاس مباشرة عند إجراء تفاعل PCR وليس بعد انتهاءه وهكذا يمكن ملاحظة الفرق مباشرة بين كل دورة وأخرى على أن الاستعمال المفضل له هو استعماله بعد الحصول على cDNA من RNA وليس من عينة DNA أصلية خاصة اذا أردنا البحث عن جين محدد طبعا" هذه التقنية مكلفة جدا" من حيث معداتها وأجهزتها والمواد الكيميائية اللازمة لها ولذلك يبقى PCR التقليدي مفضلا" في حال كانت نتيجته تكفي للحصول على جواب للسؤال المطروح