الأربعاء، 9 ديسمبر 2009

PCR

من بين آلاف الأبحاث والاختراعات ,قليلة هي الاكتشافات التي تركت أثرا" بالغا" وأسهمت في ولادة فروع علمية جديدة مثلما فعل اختراع ال PCR (اختصارا" ل Polymerase chain reaction) بحيث يصعب حصر مجالات تطبيقاته ونواحي الاستفادة منه ورغم أن طريقة استخدام الجهاز في غاية البساطة إلا أن المعلومات اللازمة لفهم آلية عمله و تهيئة أفضل الظروف للحصول على أفضل النتائج استلزمت سنوات من العمل الشاق ببساطة وكفكرة مبدئية : يقوم PCR بتضخيم عينة متناهية الصغر من DNA (وهو المادة الوراثية لكل الكائنات الحية) خارج الخلية الحية ومضاعفتها ملايين المرات بشكل لوغاريتمي وقد يتسائل البعض؟ وما الفائدة من ذلك ؟ لذلك سأضرب مثالا" بسيطا" لو أذبت ملعقة صغيرة من السكر ضمن برميل ماء ضخم جدا" فسيكون من المستحيل الاحساس بالطعم الحلو للسكر مع أنه موجود بينما لو أذبت طنا" من السكر ضمن نفس البرميل ستحس به وبشكل كبير ومنذ نشر الفكرة الأساسية في مجلة Science المشهورة عام 1985 ثم منح جائزة نوبل في الكيمياء عام 1993 للعالم الأمريكي Kary Mullis الذي يعزى له الفضل في اختراع الجهاز أحدث PCR ثورة شاملة في علم البيولوجيا الجزيئية والكيمياء الحيوية والطب الشرعي وعلم الآثار كما كان السبب في نشوء فروع علمية حديثة مثل الهندسة الجينية ومعالجة الأمراض وراثيا" والاستنساخ ٍسأحاول في هذا الموضوع إلقاء الضوء على مبدأ عمل ال PCR بطريقة مبسطة وكذلك على أهم تطبيقاته

DNA هو اختصار لل Deoxyribonucleic acid أو الحمض النووي منقوص الأوكسجين هو المادة الوراثية التي يحملها كل كائن حي في خلاياه وتحديدا" في نواة الخلية وهي تحتوي جميع المعلومات اللازمة لحياته والخصائص المميزة له والتي تجعله فردا" مختلفا" عن بقية أفراد جنسه ورغم أن DNA شفرة معقدة جدا" وطويلة للغاية إلا أنه يتكون من تتالي أربع أسس فقط مرتبة بشكل مختلف هذه الأسس هي الأدنين والغوانين والسيتوزين والتيامين أو اختصارا" A,G,C,T وتكون متصلة مع جزئ سكر وجذر فوسفات يتكون DNA من سلسلتين متقابلتين بحيث يتصل الأدنين من سلسلة مع التيامين من السلسلة الأخرى ويتصل السيتوزين من سلسلة مع الغوانين من السلسلة الأخرى

اعتبر اكتشاف بنية الDNA من قبل جيمس واطسون (James Dewey Watson) و فرانسيس كريك (Francis Crick )أهم اكتشافات القرن العشرين وقد نالا عليه جائزة نوبل في الطب عام 1962 كل صفة وراثية تسمى gene أو مورثة ولها شفرتها الخاصة بها ضمن تتالي DNA ورغم كل التطور العلمي حاليا" لم تعرف إلا وظيفة 3% فقط من DNA هي المشفرة لجميع الخصائص الوراثية للإنسان بينما بقيت 97% مجهولة الوظيفة هذه المناطق التي لا عمل لها غالبا" تفصل بين كل شفرتين وراثيتين على جزئ الDNA أيضا" ضمن الشفرة الوراثية نفسها هناك مناطق ليس لها علاقة بعمل المورثة تسمى المنطقة التي تحمل التعليمات الوراثية Exon بينما تسمى المناطق التي لا عمل لها Intron Intron تزال عند تحول DNA إلى mRNA هي الخطوة الرئيسية للتعبير عن هذه المورثة لذلك يكون mRNA مؤلفا" من تتالي Exon فقط قد يحمل الإنسان مورثة ما ضمن حمضه النووي ولكنها تكون غير ظاهرة أو أنها تظهر عند تحريضها بأمر معين اذا وجدت المورثة عند شخص ما سميت genotype واذا تم التعبير عنها ولوحظت عنده سميت phenotype فالشخص أزرق العينين يحمل حتما" المورثة الخاصة بذلك Genotype وبما أن هذه المورثة أنتجت أثرا" ملحوظا" فهي أيضا" phenotype بينما قد يحمل شخص أسود العينين مورثة اللون الأزرق للعينين لكنها غير معبر عنها ولم تحدث عنده أثرا" فهذا الشخص يملك genotype بحكم أنها ضمن مورثاته ولكنها خامدة فهو لا يملك phenotype

لكي يتم التعبير عن مورثة ما تحدث خطوتين متتاليتين الخطوة الأولى هي نسخ DNA إلى mRNA (اختصارا" ل Messanger RNA) وتسمى هذه العملية Transcription وتحدث في نواة الخلية وكما ذكرت في المشاركة السابقة يتم إزالة intron أي المناطق التي لا تساهم بعمل المورثة وبذلك يكون mRNA مكون من سلسلة واحدة فقط ومؤلفة من تتالي ال exon على أن mRNA يستبدل أحد الأسس الأربعة ل DNA وهو التيامين بأساس آخر هو اليوراسيل الخطوة الثانية هي الترجمة أو Translation وهي إنتاج البروتين الموافق للشفرة الوراثية هذه العملية تتم خارج النواة حيث يهاجر mRNA إلى جزء آخر من الخلية اسمه الريبوزومات ويتدخل نوع آخر من الRNA اسمه tRNA أو (Transfer RNA)والذي يقوم بنقل الحموض الأمينية aminoacid وهي الوحدات الأولية للبروتين إلى الريبوزومات ليتم ترتيبها بشكل يوافق الشفرة الوراثية التي يحملها الmRNA

أنزيم DNA Polymerase: اذا عدنا لبنية DNA يتم اتصال الأسس ببعضها ضمن السلسلة عن طريق الربط بين وظيفة الهيدركسيل الموجودة على الكربون رقم 3 من أحد الأسس مع مجموعة الفوسفات الموجودة على الكربون رقم 5 من الأساس الآخر وهكذا يكون الكربون رقم 5 التابع لأول أساس في السلسلة حرا" بحكم أنه مرتبط من الموقع 3 مع الأساس الذي يليه وكذلك يكون الكربون رقم 3 التابع آخر أساس في السلسلة حرا" أيضا" بحكم كونه مرتبط من الموقع 5 مع الأساس الذي سبقه ولذلك اصطلح العلماء على تسمية اتجاه DNA من 5 إلى 3 يرجى الإنتظار حتى الإنتهاء من تحميل الصورة. عند تضاعف الخلايا يتم تضاعف المادة الوراثية ايضا" لكي تحمل كل خلية جديدة نسخة من المادة الوراثية الخاصة بالخلية الأم ويحدث هذا التضاعف بواسطة أنزيم اسمه DNA polymerase هذا الأنزيم يقود عملية تضاعف الDNA باتجاه محدد من 5 إلى 3 لكن هذا الأنزيم لا يقدر أن يبدأ عملية التضاعف من تلقاء نفسه أولا" يحتاج الأنزيم إلى منطقة يستطيع البدء منها وتسمى هذه المنطقة في الخلايا الحية Origin of replication ثانيا" يحتاج الأنزيم لتوافر نيكليوتيدات حرة بحيث يرتبها بشكل مماثل للسلسلة الأصلية (النيكليوتيد هو ما يطلق على اتصال أحد الأسس الأربعة المذكورة سابقا" مع السكر والفوسفات) أي أن عمل الأنزيم يشبه بناء منزل فهو يبدأ من أساس معين ويحتاج لأحجار حتى يصفها فوق بعضها وبما أن بناء المنزل سيتوقف عند حد معين ولن يصل سقفه إلى النجوم مثلا" فهذا يقودنا إلى النقطة الثالثة ثالثا" من المهم أن يتوقف الأنزيم عند نقطة محددة فهو لن يعمل إلى مالانهاية وتوقفه يتم عن طريق تعرفه على تسلسل معين يكون هو تسلسل النهاية وهو تسلسل محدد تماما" عند وصول الأنزيم إلى هذا التسلسل يتوقف عن العمل

منذ اكتشاف دور هذا الأنزيم والدراسات التي أجريت عليه عند البشر والحيوانات , داعبت الفكرة خيال العلماء. ماذا لو تمكننا من عزل هذا الأنزيم؟؟ اذا نستطيع مضاعفة DNA خارج الخلية الحية الحقيقة أن الكلام سهل لكن التطبيق أمر آخر وقد واجهت العلماء مشكلتين عويصتين : الأولى أن عملية تضاعف الDNA تبدأ بانفصال السلسلتين المكونتين له عن بعضهما البعض وهذه الخطوة تتم في الخلية الحية أثناء انقسامها وفي درجة حرارة الجسم الطبيعية لكن لكي تحدث هذه الخطوة خارج الجسم يتوجب تعريض عينة DNA إلى درجة حرارة مرتفعة (95 درجة مئوية) لكسر الروابط الهيدروجينية بين السلسلتين وفي هذه الدرجة العالية تفقد الأنزيمات بنيتها وشكلها المميز وبالتالي تصبح بلا فعالية على الإطلاق الثانية : هي أن مكان البدء بتضاعف ال DNA وهو origin of replication يصبح بلا أي أهمية خارج الجسم وبالتالي لن يستطيع الأنزيم الارتباط به وبدء عمله وهذا يستلزم تصنيع مكان صناعي يستطيع الأنزيم الاتصال به ولكن ذلك ليس بسيطا" وهكذا اعتقد الكثيرون أن عملية تضاعف المادة الوراثية خارج الجسم هو أمر بعيد المنال

أنزيم Taq Polymerase كان اكتشاف أول بكتيريا قادرة على العيش في مياه الينابيع الحارة خطوة كبيرة في تطور الفكرة فالبكتيريا Thermus aquaticus له القدرة على الحياة في درجة حرارة 80 بما يعني أن كل وظائفه الحيوية تعمل بكفاءة بالغةوهذا يدل على أن كل أنزيماته أيضا" فعالة وناشطة وهكذا أعيد إحياء الفكرة من جديد تم عزل الأنزيم المسؤول عن تضاعف المادة الوراثية ضمن هذه البكتيريا وسمي Taq من الأحرف الأولى من اسم البكتيريا للدلالة على مصدره وجدت الدراسات أن درجة الحرارة المثلى لعمل هذا الأنزيم هي 72 درجة مئوية ولكن الأنزيم يستطيع تحمل 95 درجة مئوية وهي الحرارة المطلوبة لفصل السلسلتين عن بعضهما ولا يفقد فعاليته بعد هذا الكتشاف اكتشفت كائنات حية أخرى تعيش في أوساط حارة جدا" وعزلت أنزيماتها أيضا" ولكن يبقى Taq Polymerase هو المفضل بينهم جميعا"

المشكلة الثانية التي توجب على العلماء حلها هي مكان ارتباط الأنزيم مع الDNA لابد من تصنيع مكان يستطيع الأنزيم الاتصال به وبدء عمله ولكن كيف؟ الجواب جاء مع تقنية جديدة اسمها phosophoramidite chemistry عرفت في عام 1983 وهي تمكن من صنع سلسلة قصيرة لأي تسلسل نريده من النيكليوتيدات بحيث يكون التسلسل موافق تماما" للتسلسل الأصلي في DNA الذي نريد تضخيمه هذه السلسلة القصيرة تستطيع الارتباط باحدى سلسلتي DNA في درجة حرارة معينة تختلف باختلاف التسلسل نفسه يتوجب صنع تسلسلين بحيث يرتبط أحدهما بالسلسلة الأولى لDNA التي اتجاهها 5 إلى 3 بينما يرتبط الثاني بالسلسلة الأخرى التي اتجاهها معاكس للأولى وبالتالي 3 إلى 5 نصل الآن إلى ملخص يوضح درجات الحرارة الضرورية لتضاعف DNA خارج الخلية أولا" درجة حرارة 95 التي تمكن السلسلتين من الانفصال عن بعضهما ثانيا" درجة حرارة المكان الصناعي وهي تتغير بتغير تسلسله وهي ضرورية لاتصاله مع السلسلة الأصلية ثالثا" درجة حرارة عمل الأنزيم المثلى لعمله وفي حال أنزيم Taq Polymerase تكون الدرجة المطلوبة 72 درجة مئوية

Primers من بين جميع الخطوات المطلوبة لنجاح عملية تضاعف DNA خارج الخلية, تبقى خطوة التصميم الصحيح للمكان الصناعي الذي سيتصل به الأنزيم هي الأكثر أهمية لأنه حتى لو تم فصل السلسلتين المكونتين لDNA عن بعضهما وحتى لو كان الأنزيم في أقصى نشاطه فإن نجاح الأنزيم في مضاعفة DNA متوقف تماما" على نجاحه في الاتصال الصحيح بمكان البدء هناك عدة شروط مطلوب توفرها في مكان اتصال الأنزيم وبدء عمله ويسمى هذا المكان علميا" Primer 1- يجب أن يكون الPrimer قصيرا" في الطول ويتراوح طوله بين 17 و30 نيكليوتيد 2- يجب أن يحتوي الPrimer على الغوانين والسيتوزين بنسبة تقارب 50 % 3- بما أنه لتضاعف DNA يلزم وجود اثنين من Primer للاتصال مع كل سلسلة من DNA ,يجب أن تكون درجة الحرارة اللازمة لانصهار كل منهما متقاربة جدا"حتى يتمكن كلاهما من الاتصال بDNA في الوقت نفسه تحسب درجة الحرارة عن طريق المعادلة التالية Temperature = 2(AT) + 4 (GC فلو كان الPrimer مؤلفا" من 20 نيكليوتيد بينهم 10 غوانين وسيتوزين و10 أدنين وتيامين تكون درجة الحرارة اللازمة لانصهاره هي 2×10+4×10 = 60 درجة مئوية 4- يجب ألا يكون الPrimers متممين لبعضهما البعض لأنهما سيقومان بالارتباط ببعضهما بالاضافة إلى ارتباطهما ب DNA وهكذا سيقوم الأنزيم بمضاعفتهما أيضا" مع مضاعفة DNA وبما أن عملية التضاعف تنتج ملايين النسخ فسيتم أيضا" انتاج ملايين النسخ من المنتج الخطأ وهكذا ستكون نسبة الخطأ كبيرة جدا" كذلك يجب ألا يكون الPrimer الواحد يتمم نفسه لنفس السبب والحقيقة أن العمل مع جهاز PCR يتطلب حذرا" شديدا" لأن أي خطأ سيكون كبيرا" في النهاية

أفضل الظروف لأفضل النتائج: بعد اكتشاف الأنزيم المتحمل Taq Polymerase لدرجة الحرارة العالية وبعد التصميم الصحيح لل Primers بقيت عدة أمور بسيطة لابد من تحسينها للحصول على نتائج ممتازة وإنني عندما أقصد بسيطة لا أعني أنها لا تؤثر على التفاعل , بالعكس فإن نجاح الأبحاث العلمية متوقف تماما" على التفاصيل الدقيقة , وإنما أعني أن تطويرها لم يكن صعبا" بالمقارنة مع تصميم الPrimer و Taq Polyemerase أولا" : درجة الحموضة pH اللازمة للتفاعل: تتأثر فعالية الأنزيمات تماما" بدرجة حموضة الوسط فلكل أنزيم درجة pH مثلى له يعمل فيها بكفاءة بالغة وتقل كفاءته كلما ابتعد عنها وجدت الأبحاث أن درجة الحموضة pH المثلى لعمل أنزيم Taq Polymerase هي pH=8 وللحفاظ على درجة الحموضة ثابتة طوال مدة التفاعل يستعمل الباحثون ما يسمى buffer أو وقاء وهو يكون عادة مقاوم للتغيرات الشديدة في درجة الحموضة ومن أفضل الوقاءات المستخدمة لتضخيم DNA عند استعمال Taq Polymerase هو المركب الكيميائي Tris مضافا" له حمض كلور الماء ليعطيه درجة الحموضة رقم 8 ثانيا" : شوارد المغنيزيوم Mg : تعتمد الكثير من الأنزيمات على وجود المعادن في القيام بعملها فبعضها يحتاج الزنك وبعضها الحديد وبالنسبة ل DNA Polymerase فهي تحتاج إلى المغنيزيوم بتراكيز معينة ثالثا": بعض الأملاح رابعا" : اختيار التراكيز الملائمة من الأنزيم وPrimers و النيكليوتيدات الحرة في الوسط والآن نحن جاهزون لإجراء تفاعل PCR

تفاعل PCR : يكون حجم التفاعل عادة يتراوح بين 50 و100 ميكروليتر (الميكروليتر هو واحد على ألف من الميلي ليتر أي 3- 10ميلي ليتر أو 6- 10ليتر ) وسبب اختيار الحجم الصغير للتفاعل هو تسهيل وتسريع الوصول لدرجة الحرارة المطلوبة طالما أن تفاعل PCR يعتمد على تغيرات درجة الحرارة أو ما يسمى بالدورة الحرارية thermal cycle يتم مزج المركبات التالية مع بعضها: الوقاء الحافظ درجة الحموضة مع الأملاح النيكليوتيدات الحرة شوارد المغنيزيوم Primer الأول Primer الثاني أنزيم Taq Polymerase عينة DNA المراد تضخيمها ويكمل حجم التفاعل إلى الحجم المطلوب بواسطة الماء المقطر بما أن الأحجام المطلوب أخذها بدقة هي من فئة الميكروليتر مما قد يرفع هامش الخطأ يفضل تحضير مزيج واحد لعدد العينات المطلوب تحليلها بمضاعفة الكمية الواجب أخذها من كل محلول حسب عدد العينات ثم إضافة DNA بشكل منفرد إلى كل مزيج 1- Denaturation: يبدأ التفاعل بتسخين المحلول لدرجة 95 درجة مئوية لفك سلسلتي الDNA عن بعضهما وتسمى هذه المرحلة Denaturation أي تغيير طبيعة DNA 2- Annealing: ثم تخفض درجة الحرارة إلى الحرارة المطلوبة لاتصال Primers مع DNA وهي أقل من درجة انصهار الPrimers بعدة درجات في مثالنا اذا كانت درجة انصهار الPrimers 60 درجة مئوية يفضل اختيار درجة الحرارة 55-56 درجة مئوية وتسمى هذه المرحلة Annealing وهي أهم مرحلة 3- Extension: في هذه المرحلة يبدأ الأنزيم عمله ولذلك تكون درجة الحرارة 72 درجة مئوية وهي الدرجة المثلى لعمل أنزيم DNA polymerase سابقا" كانت تغييرات درجة الحرارة تتم يدويا" بنقل العينات من درجة لأخرى ومن حمام مائي لآخر وهذا كان متعبا" ومستهلكا" للوقت أما الآن فهناك جهاز يقوم بالمهمة يرجى الإنتظار حتى الإنتهاء من تحميل الصورة.إضغط هنا لرؤية الصورة بشكل كبير في إطار منفصل يرجى الإنتظار حتى الإنتهاء من تحميل الصورة.

كيف يتضاعف DNA عندما يبدأ التفاعل تنفصل السلسلتان عن بعضهما ثم يتصل كل Primer بالسلسلة الموافقة له وعندما تصل درجة الحرارة للدرجة المثلى لعمل الأنزيم يبدأ بتكوين سلسلتين جديدتين وهنا تنتهي الدورة الأولى وتبدأ الثانية بانفصال السلاسل الأربعة لجزيئ الDNA عن بعضها وهكذا أي ابتداءا" من نسخة واحدة من الDNA 1- الدورة الأولى يصبح عندنا نسختين 2- الدورة الثانية يصبح عندنا 4 نسخ 3- الدورة الثالثة يصبح عدد النسخ8 4- الدورة الرابعة يصبح عدد النسخ 16 5- الدورة الخامسة يصبح عدد النسخ 32 6- يصبح عدد النسخ 64 7- يصبح عدد النسخ 128 8- يصبح عدد النسخ 256 9- يصبح عدد النسخ 512 10- يصبح عدد النسخ 1024 11- يصبح عدد النسخ 2048 12- ا يصبح عدد النسخ 4096 13- يصبح عدد النسخ 8192 14- يصبح عدد النسخ 16384 15- يصبح عدد النسخ 32768 16- يصبح عدد النسخ 65536 17- يصبح عدد النسخ 131072 18- يصبح عدد النسخ 262144 19- يصبح عدد النسخ 524288 20- يصبح عدد النسخ 1048576 21- يصبح عدد النسخ 2097152 22- يصبح عدد النسخ 4194304 23- يصبح عدد النسخ 8388608 24- يصبح عدد النسخ 16777216 25- يصبح عدد النسخ 33554432 26- يصبح عدد النسخ 67108864 27- يصبح عدد النسخ 134217728 28- يصبح عدد النسخ 268435456 29- يصبح عدد النسخ 536870912 30- يصبح عدد النسخ 1073741824

ليست هناك تعليقات:

إرسال تعليق